eDNA ja muut molekyylibiologiset seurantamenetelmät

Molekyylibiologisten menetelmien avulla voimme parantaa ympäristön tilan seurantojen kattavuutta, tarkkuutta ja kustannustehokkuutta ja siten täydentää seurannan kautta muodostuvaa kuvaa luonnon monimuotoisuudesta ja sen muutoksista.

Tällä sivulla:

• Mitä molekyylibiologiset seurantamenetelmät ovat?
• Yleisimmät molekyylibiologiset menetelmät
• Menetelmien mahdollisuudet ja haasteet
• Standardointi ja laadunvarmistus
• Käyttöönotto Suomessa
• Miten otan molekyylibiologiset menetelmät käyttöön?
• Tervetuloa kansalliseen eDNA-ideointitiimiin
• Resurssit

Mitä molekyylibiologiset seurantamenetelmät ovat?

Molekyylibiologisilla seurantamenetelmillä tarkoitetaan DNA- tai RNA-analyysiin perustuvia tekniikoita, joita on mahdollista hyödyntää luonnon seurannassa. DNA:n perusteella voidaan havaita yksittäinen kohdelaji tai määrittää jopa satoja lajeja yksittäisistä näytteistä. Myös populaatiorakennetta ja muuta lajin sisäistä vaihtelua voidaan tutkia DNA-menetelmillä. RNA-pohjaiset menetelmät tuottavat tietoa tutkitussa ympäristössä ilmenevistä geeneistä ja siten ekosysteemissä käynnissä olevista biologisista prosesseista.

Monenlaiset näytteet voivat toimia molekyylibiologisten analyysien lähdemateriaalina. Lajintunnistuksen varmistamiseen ja lajinsisäisen geneettisen vaihtelun tutkimiseen hyödynnetään useimmiten suoraan eliöstä otettuja kudosnäytteitä tai esimerkiksi ulostenäytteitä.

Ympäristö-DNA-näytteistä pyritään tavallisesti joko tunnistamaan tietty kohdelaji tai selvittämään tietyn eliöryhmän tai -ryhmien lajisto mahdollisimman kattavasti. Myös perinteisillä biologisilla menetelmillä kuten erilaisilla pyydyksillä kerätyistä näytteistä voidaan määrittää lajisto morfologisen määrityksen sijaan DNA:n perusteella homogenisoidusta kokooma- tai bulkkinäytteestä tai esimerkiksi näytteen säilönnässä käytetystä nesteestä.

Jopa satojen lajien samanaikaisen havaitsemisen mahdollistavan massiivisen rinnakkaissekvensoinnin ja muiden menetelmien kustannukset ovat viime vuosina merkittävästi laskeneet. Menetelmäketjut aina näytteenotosta tulosten tulkintaan ovat kehittyneet asteelle, joka mahdollistaa niiden laajamittaisen, rutiininomaisen käytön ympäristön seurannassa. Uusien menetelmien avulla voidaan parantaa seurannan kattavuutta, tarkkuutta ja kustannustehokkuutta ja siten täydentää seurannan kautta muodostuvaa kuvaa luonnon monimuotoisuudesta ja sen muutoksista.

Yleisimmät molekyylibiologiset menetelmät

Yksittäisen kohdelajin tunnistus ja runsausmääritys: PCR-testit, qPCR, dPCR, ddPCR

PCR-testissä esimerkiksi ympäristönäytteestä eristetystä DNA:sta monistetaan vain kohdelajin DNA lajikohtaisen alukkeen avulla. Kvantitatiivisillä PCR-menetelmillä (qPCR, dPCR, ddPCR) pystytään määrittämään myös kohdelajin DNA:n runsaus näytteessä.

Lajiston selvittäminen: metaviivakoodaus (2. ja 3. sukupolven sekvensointi)

Metaviivakoodauksessa yhdestä näytteestä tuotetaan massiivisella rinnakkaissekvensoinnilla jopa satoja tuhansia tietyn viivakoodialueen sekvenssejä, jotka voidaan tunnistaa vertaamalla DNA-emäsjärjestystä sekvenssitietokantaan. Kohteena oleva eliöryhmä rajautuu viivakoodialueen sekä DNA:n monistuksessa käytettävien PCR-alukkeiden mukaan. Kyseisen eliöryhmän osalta metaviivakoodauksen avulla pystytään parhaimmillaan selvittämään suuri osa näytteen lajistosta. Lisäksi menetelmällä saadaan viitteitä lajien runsaussuhteista. Tunnistettujen lajien osuus ja tunnistusten tarkkuus ja luotettavuus riippuu ensisijaisesti käytetyn referenssitietokannan laadusta ja kattavuudesta.

Metaviivakoodauksessa käytetään yleisimmin ns. toisen sukupolven sekvensointiteknologiaa (esim. Illumina NovaSeq, MiSeq, NextSeq), joka vaatii DNA:n monistamista ja sekvensoinnin rajaamista tietylle, enimmillään n. 300 emäsparin pituiselle geenialueelle. Uudemman ns. kolmannen sukupolven sekvensointiteknologian (esim. Oxford Nanopore, PacBio) avulla voidaan tuottaa huomattavasti pidempiä sekvenssejä (kymmeniä tai satoja tuhansia emäspareja) koko genomin alueelta, eikä DNA:n monistaminen ole välttämätöntä.

Periaatteessa uusi teknologia mahdollistaa kaikkien eliöryhmien tavoittamisen samalla analyysillä sekä myös lajinsisäisen vaihtelun tarkastelun. Käytännössä menetelmän hyödyntämistä rajoittaa kuitenkin vielä kokonaisten genomien ja genomikirjastojen kattavuus, ympäristönäytteistä saatavan DNA:n pilkkoutuminen pienemmiksi paloiksi ja jossain määrin myös pitkien sekvenssien puutteellinen laatu.

Lajinsisäisen vaihtelun selvittäminen: yksittäisten geenien sekvensointi, genomiikka, SNP-, mikrosatellittimarkkerit

Nykymenetelmillä lajinsisäisen vaihtelun selvittäminen edellyttää useimmiten näytteitä, jotka voidaan yhdistää yksittäiseen yksilöön tai johonkin tiettyyn populaatioon. Lajinsisäisen vaihtelun määrittämistä eDNA-näytteistä ollaan kehitetty muutamissa tutkimushankkeissa, mutta soveltuvat menetelmät ovat vielä toistaiseksi saavuttamattomissa useimpien lajien kohdalla.

Lajinsisäistä geneettistä monimuotoisuutta voidaan arvioida hyvin monella eri menetelmällä, jotka pyrkivät vastaamaan hieman toisistaan poikkeaviin kysymyksiin ja eroavat myös siinä kuinka paljon taustatietoa eliön geneettisestä rakenteesta täytyy olla, jotta kyseistä menetelmää voidaan soveltaa. Sekvensointikustannusten laskiessa ja menetelmien kehittyessä geneettisen taustatiedon kerääminen ei kuitenkaan enää nykypäivänä muodosta kovinkaan suurta pullonkaulaa luonnonpopulaatioiden lajinsisäisen geneettisen monimuotoisuuden tarkastelulle. 

Menetelmien mahdollisuudet ja haasteet

eDNA ja muut molekyylibiologiset menetelmät mahdollistavat kansainvälisesti helposti vertailtavan ja toistettavan lajintunnistuksen. Niiden avulla voidaan myös tavoittaa monia vaikeasti havaittavia ja huonosti tunnettuja eliöryhmiä, jotka jäävät perinteisiin menetelmiin perustuvien seurantojen ulkopuolelle. Esimerkiksi paikallisilla vesi- ja ilmanäytteillä voidaan tavoittaa joko yksittäisiä lajeja tai koko lajisto laajalta alueelta, jonka kartoittaminen perinteisin menetelmin ei olisi kustannusten takia mahdollista.

Vaikka molekyylibiologisilla menetelmillä pystytään huomattavasti täydentämään kokonaiskuvaa luonnon monimuotoisuudesta, ne eivät kuitenkaan tuota täysin perinteiseen lajinmääritykseen perustuviin menetelmiin verrattavaa tietoa. Metaviivakoodauksella ei esimerkiksi saada tietoa lajien yksilömääristä eikä yksilöiden ominaisuuksista kuten iästä, koosta tai sukupuolesta. Lisäksi metaviivakoodauksella saatava tieto lajien suhteellisista runsaussuhteista on vielä tällä hetkellä yleensä vain suuntaa antavaa. Menetelmiä kuitenkin kehitetään koko ajan kvantitatiivisempaan suuntaan.

Toinen merkittävä haaste liittyy ympäristö-DNA-aineiston tulkintaan. Koska ympäristö-DNA:lla havainnoidaan esimerkiksi vedessä esiintyvää DNA:ta eikä suoraan eläviä yksilöitä, on tapauskohtaisesti arvioitava, mitä havainnot kertovat yksilöiden esiintymisestä. DNA:n kulkeutumiseen ja hajoamisnopeuteen ympäristössä vaikuttavat lukuisat eri tekijät, kuten virtausolot, lämpötila ja auringonvalo. DNA:n hajoamista ja kulkeutumista eri ympäristöissä on selvitetty monissa tieteellisissä tutkimuksissa, joiden tulokset on syytä ottaa huomioon molekyylibiologista seurantaa suunniteltaessa. Myös erilaiset DNA:n kulkeutumista kuvaavat mallit ovat hyödyllisiä mahdollisten lähdealueiden arvioimisessa, mutta myös mallien ennusteisiin liittyy väistämättä aina epävarmuutta.

Molekyylibiologisia seurantamenetelmiä kehitetään parhaillaan aktiivisesti ympäri maailmaa eri eliöryhmille ja ekosysteemeille, ja yksittäisiä menetelmiä on useissa maissa otettu myös rutiininomaiseen käyttöön. Laajassa mittakaavassa molekyylibiologisten menetelmien käyttö seurannassa on kuitenkin vielä kokeiluasteella, ja kehittämishankkeiden ja asiantuntijuuden kenttä on hajanainen.

Riittämätöntä rahoitusta, osaavien tekijöiden puutetta, referenssikirjastojen aukkoja erityisesti tiettyjen pohjoisten lajiryhmien osalta ja kansainvälisten menetelmästandardien puutetta pidetään alan asiantuntijoiden keskuudessa tärkeimpinä menetelmien käyttöönottoa rajoittavina tekijöinä. Kansallisia ja kansainvälisiä metodologisia ohjeita on olemassa, mutta ne ovat hajallaan, eikä vähimmäisvaatimuksia ole yleisesti hyväksytty tai sovittu, eli todellisia, yhteisesti hyväksyttyjä standardeja ei vielä juurikaan ole. Hajautettu rahoitus aiheuttaa helposti sen, että ohjeistuksia kehitetään kansallisella tai organisaatiotasolla, mutta projektien ja eri maiden välillä tapahtuvaa tiedonvaihtoa tai opittujen kokemusten jakamista ei tehdä tarpeeksi. Tämä aiheuttaa suuren riskin sille, etteivät molekyylibiologiset datat ole kansainvälisellä tasolla vertailukelpoisia.

Standardointi ja laadunvarmistus

Kansainvälinen menetelmästandardointi on erittäin tärkeää molekyylibiologisten aineistojen laadun ja vertailtavuuden varmistamiseksi. Standardointi on tällä hetkellä vielä alkuvaiheessa, mutta sitä edistetään aktiivisesti monin eri toimin Suomessa ja kansainvälisesti.

CEN-standardi EN 17805:2023 Water quality – Sampling, capture and preservation of environmental DNA from water on julkaistu alkuvuodesta 2023. eDNA-teemaista työryhmää ollaan perustamassa ISO/TC 147/SC 5/WG13 “Environmental DNA and RNA methods” alle. Sekä jo julkaistun CEN standardin, että nyt perusteilla olevan ISO-standardin työryhmistä vastaa kehittämispäällikkö Kristian Meissner Suomen ympäristökeskuksesta. 

International eDNA Standardization Task Force iESTF (https://iestf.global/(siirryt toiseen palveluun)) perustettiin kansainvälisen GEO BON -konferenssin yhteydessä Montrealissa lokakuussa 2023. iESTF tekee tiivistä yhteistyötä kansainvälisen tutkimusyhteisön sekä erilaisten sidosryhmien kanssa. 

Käyttöönotto Suomessa

Molekyylibiologiset seurantamenetelmät ovat Suomessa vielä enimmäkseen kokeiluasteella, mutta kehitys on nopeaa. Menetelmäkehitystä ja pilotointia tehdään yliopistojen lisäksi kaikissa keskeisissä ympäristön seurantaa koordinoivissa laitoksissa (Syke, Luke, Luonnontieteellinen keskusmuseo, Metsähallitus, Ilmatieteen laitos, Terveyden ja hyvinvoinnin laitos, Ruokavirasto).

Rutiinikäytössä menetelmät ovat vasta yksittäisillä riista- ja kalalajeilla. Kokonaisten lajiyhteisöjen seurantaa metaviivakoodausmenetelmillä ei Suomessa vielä ole otettu rutiininomaiseen käyttöön, mutta laajamittaista pilotointia on tehty tai käynnissä erityisesti vesieliöillä kuten plankton- ja päällyslevillä, pohjaeläimillä ja kaloilla. Maaympäristössä metaviivakoodaukseen perustuvaa laajamittaista seurantaa pilotoidaan erityisesti niveljalkaisilla ja sienillä.

Molekyylibiologisten seurantamenetelmien käyttöönottoa pyritään Suomessa edistämään mm. tutkimusrahoituksella ja eri toimijoiden välisellä koordinaatiolla ja yhteistyöllä. Molekyylibiologiset menetelmät ovat mukana ympäristöministeriön julkaisemassa Ympäristön tilan seurannan strategiassa 2030, ja Suomen ympäristökeskus ja Luonnonvarakeskus ovat laatineet tiekartan molekyylibiologisten seurantamenetelmien käyttöönotolle.

Kansallinen eDNA-tiekartta(siirryt toiseen palveluun)

Taulukko: Molekyylibiologiset seurantamenetelmät Suomessa

Miten otan molekyylibiologiset menetelmät käyttöön?

Olemme koonneet vastauksia konkreettisiin kysymyksiin, joita herää molekyylibiologisten seurantamenetelmien käytöstä kiinnostuneille. Jos et löydä sinua askarruttavaan kysymykseen vastausta, voit ottaa yhteyttä niin pyrimme auttamaan.

Resurssit

Lisätietoja

Veera Norros
Tiina Laamanen
etunimi.sukunimi@syke.fi